вход
Классические показания к экстракорпоральному оплодотворению предусматривают непроходимость маточных труб, умеренный мужской фактор и неэффективность прежних методов лечения. Данный метод разработал коллектив британских врачей и эмбриологов под руководством Эдвардса и Стептэ. В результате проведенных ими исследований 25 июля 1978 года в Англии родилась Луиз Браун – первый в истории человек в мире, родившийся в результате искусственного (экстракорпорального) оплодотворения и перенесения развивающегося эмбриона в полость матки. Эффективность первых экспериментов, проводимых в естественном цикле, была относительно низкой. Только применение стимуляции овуляции, а вскоре и контролируемой гиперстимуляции яичников, существенно ее повысило.
Благодаря этому лечение бесплодия методом IVF быстро завоевало признание во всем мире. Через девять лет, 12 ноября 1987 года в Институте акушерства и гинекологии в Белостоке родился первый ребенок, зачатый в результате экстракорпорального оплодотворения, проведенного в Польше. В настоящее время IVF — широко распространенный во всем мире, одобренный метод лечения, а показания к его применению охватывают почти все этиологические факторы бесплодия.
показания
Показания к лечению методом экстракорпорального оплодотворения в соответствии с новейшими рекомендациями Польского общества репродуктивной медицины включают:
1) Трубно-перитонеальный фактор*
1. у пациенток с серьезным повреждением маточных труб
2. у пациенток, которым противопоказано оперативное лечение
3. у пациенток со слабой функцией маточных труб при сохраненной проходимости или после микрохирургической операции и истечении 2-х лет без беременности; условием рекомендации ожидания является отсутствие других факторов, которые могут влиять на возможность забеременеть (нездоровая сперма, возраст женщины > 35 лет, длительность бесплодия < 3 лет, эндометриоз, нарушения овуляции)
2) Бесплодие неопределенной этиологии **
1. если длится более 3-х лет
2. если возраст пациентки более 35 лет – быстрее
3) Мужской фактор
1. общее количество подвижных сперматозоидов < 1 млн – показано проведение ICSI
2. количество подвижных сперматозоидов 1 – 10 млн – в случае бесплодия более 2-х лет**
3. количество сперматозоидов > 10 млн – как при идиопатическом бесплодии
4) Эндометриоз
1. I, II степень, как при бесплодии невыясненного происхождения
2. III, IV степень, как при проблемах с маточными трубами
5) Гормональные нарушения**
1. 12 циклов стимуляции безрезультатно
6) Неудачные попытки внутриматочной инсеминации domacicznej
1. максимально 6 попыток — возраст до 35 лет
2. максимально 4 попытки — возраст более 35 лет
* показано удаление маточной трубы в случае водянки
** следует рассмотреть проведение 4-х – 6-ти внутриматочных инсеминаций перед выполнением IVF/ICSI
*показано удаление маточной трубы в случае водянки
** следует рассмотреть проведение 4-х – 6-ти внутриматочных инсеминаций перед выполнением IVF/ICSI
7) В настоящее время лечение методом экстракорпорального оплодотворения применяется также у пар с нормальной репродуктивной функцией, у которых:
1. партнер является носителем вирусов HIV, HCV, а партнерша не инфицирована
2.пара является носителем генетических изменений, которые влекут за собой тяжелые необратимые изменения у потомства, а доимплантационная генетическая диагностика позволяет избежать сложного решения о прерывании беременности
3. партнерша начинает лечение онкологического заболевания, которое с высокой вероятностью необратимо повредит яичники
4. при индуцировании овуляции образуется большое количество развивающихся фолликул и данная ситуация влечет за собой высокий риск развития многоплодной беременности.
Ход лечения
Лечение методом экстракорпорального оплодотворения можно разделить на несколько этапов.
– Фармакологическая стимуляция яичников
Первый из этапов заключается в фармакологической стимуляции яичников для обеспечения роста и созревания граафовых пузырьков. Большинство исследователей, занимающихся лечением бесплодия, считают, что данный процесс является ключевым элементом терапии. Конечный результат лечения в большой степени зависит от успеха индуцирования овуляции. В наиболее часто применяемых схемах стимуляции аналоги GnRH вводятся одновременно с гонадотропинами. Следует провести ультразвуковую оценку хода стимуляции (оценку количества и диаметра растущих фолликул) и определения концентрации эстрадиола (E2) в сыворотке крови как показателя эндокринной функции развивающихся граафовых фолликул. После достижения доминирующими фолликулами доовуляционного размера >18 мм и средней концентрации E2 на уровне 150-200 pg/пузырек, внутримышечное введение 10 000 единиц хорионического гонадотропина (hCG – human choriogonadotropin) стимулирует экзогенный овуляционный пик лютеинизирующего гормона (LH – luteinizing hormone).
– пункция яичников
Забор яйцеклеток проводится через 34-36 часов после введения hCG посредством пункции, под контролем ультразвукового исследования. Для этого используются трансвагинальные зонды (5-7,5 МГц) с направляющей для процедур, выполняемых через задний свод влагалища. В полученной фолликулярной жидкости следует найти яйцеклетки и перенести их в питательную среду. Яйцеклетка окружена лучистым венцом и клетками яйценосного бугорка (OCCC – oocyte-corona radiata-cumulus complex). Морфология OCCC, при оценке степени рассредоточения яйценосного холмика и лучистого венца, является основанием для классификации качества и степени зрелости яйцеклетки. Несозревшие генетически яйцеклетки, находящиеся на этапе зародышевого пузырька (GV – germinal vesicle) и отмирания зародышевого пузырька (GVBD – germinal vesicle breakdown), не способны к оплодотворению.
– оплодотворение яйцеклеток и развитие эмбрионов
Сперматозоиды, используемые в ходе экстракорпорального оплодотворения подготавливаются методом восходящей миграции или центрифугирования в прерывистом градиенте Перколла. Перед инсеминацией яйцеклетки инкубируются в течение примерно 3-х часов, что обеспечивает их окончательное созревание. К ооцитам (незрелой форме будущих яйцеклеток) на пластинке с питательной средой добавляется примерно 100 000 сперматозоидов, а через 19 часов инкубации — оценивается количество пронуклеусов (PN – pronucleus). Их наличие свидетельствует о совершенном оплодотворении. В правильно оплодотворенных яйцеклетках присутствуют два пронуклеуса, а в перивителлиновом пространстве — также два полярных тельца. Оплодотворенные клетки переносятся в новую питательную среду. Примерно 5-10% клеток оплодотворяется неправильно, о чем свидетельствует наличие более чем двух пронуклеусов. Их дальнейшее выращивание следует прекратить. Примерно через 28-32 часа после оплодотворения проводится первое эмбриональное разделение и видны два бластомера. На вторые сутки эмбрионы состоят из 3-5 клеток, спустя следующие 48-72 часов достигают стадию морулы и бластоцисты. В полость матки можно переносить эмбрионы на 2-е, 3-ьи или 5-ые сутки после оплодотворения. В морфологической классификации эмбрионов оценивается темп клеточного деления, симметрия бластомеров и степень их фрагментации. Самый большой потенциал развития имеют эмбрионы с быстрым темпом деления, состоящие из ровных бластомеров, не проявляющие фрагментации. Шанс забеременеть уменьшается пропорционально увеличению степени морфологических отклонений в эмбрионе.
– трансфер эмбриона/эмбрионов
Исторически в полость матки осуществлялся перенос — в зависимости от стандартов той или иной страны и центра — от одного до четырех, порой даже большего количества эмбрионов. В настоящее время стандартом стал трансфер одного эмбриона женщинам в возрасте до 35 лет и максимум двух — женщинам старше 35 лет. Такой порядок рекомендует также Польское общество репродуктивной медицины, рекомендаций которого мы в «КРИОБАНКЕ» и придерживаемся. Трансфер эмбрионов в матку осуществляется через шейку с помощью специальных катетеров. Эмбрионы, не использованные для трансфера, криопрезервируются на этапе раннего эмбрионального развития (4-6 бластомеров) или после достижения стадии бластоцисты при продленном выращивании.
— поддержка лютеиновой фазы
Все авторы едины в мнении, что в результате программы экстракорпорального оплодотворения развивается лютеиновая недостаточность, являющаяся последствием нарушения функции желтого тела. Среди причин данного факта указывается аспирация зернистых клеток во время процедуры забора яйцеклеток, а также низкая концентрация LH вследствие действия агонистов GnRH. Этим также обусловлена принятая практика поддержки второй фазы цикла гестагенами. В ее ходе во второй фазе цикла применяется прогестерон, вводимый внутримышечно в количестве 25 – 100 мг в сутки или же внутрь влагалища в количестве 90-600 мг в сутки. Другим видом поддержки является принимаемый перорально дидрогестерон (Duphaston — «Дуфастон») или же эстрадиола-валерианат с капронатом 17 β-гидроксипрогестерона (Gravibinon — «Гравибинон»), вводимый внутримышечно. Поддержка второй фазы цикла возможна также с помощью hCG. В контрольных исследованиях самая большая эффективность была подтверждена при внутримышечном применении прогестерона и hCG, а также при введении прогестерона внутрь влагалища.
Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида — ICSI
Впервые примененный еще более 10 лет назад метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI – intracytoplasmic sperm injection) заключается в непосредственном микрохирургическом введении мужской гаметы в цитоплазму яйцеклетки. Это позволяет избежать большинства этапов естественного взаимодействия гамет, и соответственно, исключить некоторые причины бесплодия, связанные с мужским фактором. Наиболее частые показания — это малое количество сперматозоидов (олигоспермия), нарушенная подвижность (астеноспермия) и неправильное строение (тератоспермия), проявляющиеся в изолированных и комбинированных формах (OAT – олигоастенотератозооспермия). ICSI также является единственным методом в случаях отсутствия сперматозоидов в сперме (азооспермия), как обтурационного, так и необтурационного происхождения, а также нарушений эякуляции и некроспермии.
В части индуцирования овуляции и получения женских гамет, ICSI существенно не отличается от классического IVF. В случае мужчин, сперма которых содержит сперматозоиды, подготовка спермы предусматривает классические препаративные методы, такие как промывание, восходящая миграция или седиментация и деление в градиенте плотности Перколла. В ситуациях, когда доступны только отдельные гаметы, промывка и центрифугирование эякулята считается достаточным методом. В случаях обструктивной (экскреторной) азооспермии сперматозоиды получают благодаря микрохирургической аспирационной биопсии придатков яичек (MESA – microsurgical epididymal sperm aspiration) или яичек (TESA – testicular sperm aspiration). Отобранные путем пункции яичников ооциты подвергаются краткосрочному действию гиалуронидазы для удаления зернистых клеток, образующих яйценосный бугорок и лучистый венец. Это обеспечивает точную оценку зрелости ядра и состояния ооплазмы.
Ооциты, находящиеся в метафазе II-го мейотического деления, обнаруживают наличие I-го полярного тельца в перивителлиновым (околожелточным) пространстве и могут подвергаться непосредственной процедуре микроинъекции. Яйцеклетки с небольшой степенью незрелости, находящиеся в метафазе I-го деления, после краткосрочного выращивания (6-12 часов) обычно полностью созревают in vitro. Ооциты, находящиеся в профазе первого мейотического деления, не достигают полной зрелости в условиях in vitro и не оплодотворяются. В основной части процедуры проводится идентификация сперматозоида с наиболее благоприятными параметрами строения и подвижности, его обездвиживают путем механического повреждения жгутика и вводят внутрь инъекционной микропипетки. Удерживаемый пипеткой ооцит позиционируется таким образом, чтобы полярное тельце находилось на двенадцати часах.
В данном положении введение инъекционной микропипетки осуществляется в положении на отметке трех часов в связи с позицией веретена деления II-го мейотического деления, чаще всего расположенного под полярным тельцем. Непосредственно после пенетрации прозрачной перегородки аспирирует ооплазму внутрь пипетки, что позволяет прервать оолему и сохранить сперматозоид в ооплазме. Медленное изъятие пипетки должно обеспечить начало восстановительных процессов оолемы. На 9-й-12-й час после процедуры обычно возможна оценка активации яйцеклетки и прохождения ее оплодотворения. Дальнейшие этапы процедуры аналогичны, как в случае классического метода экстракорпорального оплодотворения и предусматривают наблюдение за развитием эмбриона, выбор эмбрионов с самым большим потенциалом развития и их пересадку в матку, криоконсервацию «излишних» эмбрионов и поддержание лютеиновой фазы.
TESA / PESA
Иногда в мужской сперме вообще не обнаруживаются сперматозоиды. В этом случае важно ответить на вопрос: вырабатывают ли яички мужчины сперматозоиды?
В этом случае необходим предварительный анализ уровня гормонов и оценка размера и консистенции яичек. В большинстве случаев необходима также генетическая диагностика мужчины и женщины, позволяющая оценить риск наличия генетических нарушений у потомства. Если результаты анализов положительны, мы проводим процедуру тонкоигольной биопсии яичек или придатков яичек. Она проводится под общей анестезией, соответственно является безболезненной и малотравматичной для мужчины. Уже через час он может покинуть клинику. Если полученный в результате биопсии материал содержит живые сперматозоиды, то возможно оплодотворение техникой микроинъекции внутрь яйцеклетки, описанное выше. В любом случае полученные из яичек или придатков яичек сперматозоиды замораживаются для последующего использования. В случае отсутствия живых сперматозоидов остается только использовать сперму донора или процедуру усыновления (удочерения).
IMSI
(англ. Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection), означает интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида, отобранного на основе морфологии методом большого увеличения и высокого разрешения. Метод IMSI базируется на методе ICSI, отличается способом выбора сперматозоида, который будет использован для микроманипуляции.
Эффективность лечения с применением экстракорпорального оплодотворения, несмотря на то, что является очень высокой, все же неудовлетворительна в некоторых группах пациентов. Поэтому также во всем мире вводятся новые методы, которые могут положительно повлиять на клинические результаты. Применение неинвазивных, лишенных риска методов, обеспечивающих улучшение прежних результатов, является идеальным решением. В данном случае метод IMSI является наилучшим того примером.
Все чаще в лечении бесплодия с целью повышения шансов оплодотворения применяются препаративные методы, позволяющие получить фракции сперматозоидов наилучшего качества. Это особо важно при применении процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI). Выбор сперматозоидов производится на основе их строения и параметров движения. Однако в некоторых случаях мужского бесплодия, с помощью нормального технического оснащения для ICSI, выбор здорового сперматозоида эмбриологом может быть осложнен. Благодаря IMSI перед инъекцией сперматозоида в яйцеклетку оценивается его головка (яичко) при очень большом увеличении, что существенно облегчает выбор.
Применение IMSI повышает также шансы в ситуации слабого ответа яичников на стимуляцию. Получение малого количества ооцитов создает риск, что после их оплодотворения мы не получим достаточного количества здоровых зигот. Метод IMSI посредством возможности выбора наилучших сперматозоидов повышает шансы на получение здоровых эмбрионов, и соответственно, шансы на беременность.
Клинические исследования подтверждают, что примененные методы IMSI позволяют улучшить показатели беременностей, а также снижают процент выкидышей. Процедура особенно рекомендуется парам, которые ранее имели опыт безуспешных процедур ICSI, при тяжелом мужском факторе бесплодия, при выкидышах в анамнезе.
На следующих снимках приведено сравнение визуализации сперматозоида при использовании метода ICSI и IMSI. Благодаря столь большому увеличению, примененному в методе IMSI, мы можем точно оценить морфологическую структуру сперматозоида и выбрать один с идеальным строением.
ЭМБРИОСКОП
Является оборудованием, обеспечивающим постоянное наблюдение за развитием эмбрионов с момента оплодотворения ооцита, и пока он не будет перенесен в матку или осуществлена криоконсервация. Забранные во время пункции яичников яйцеклетки оплодотворяются в эмбриологической лаборатории, а затем помещаются в соответствующие питательные среды и располагаются в инкубатор CO2. Поддерживаемые там температура, влажность и состав газов обеспечивают оптимальные условия для развития эмбрионов. Заданием эмбриолога является оценка темпа деления эмбриона, определение количества и симметрии разделяющихся клеток (бластомеров), степени фрагментации ранних эмбрионов и правильность строения эмбриона на пятые сутки развития (бластоцисты). Следует подчеркнуть, что развитие эмбриона является процессом чрезвычайно динамичным, а происходящие в нем изменения, очень быстрыми. Ввиду этого классическая разовая оценка эмбриона под микроскопом в течение 24 часов выращивания, не позволяет увидеть, порой ключевых особенностей развития, определяющих потенциал развития эмбриона. Более частая оценка, связанная с изъятием эмбрионов из инкубатора и наблюдением под микроскопом, может неблагоприятно повлиять на его развитие в связи с нестабильными условиями выращивания.
В настоящий момент возможно непрерывное автоматическое наблюдение и документальное фиксирование этапов развития эмбрионов без необходимости изъятия их из инкубатора. Это обеспечивает техника таймлапс. Эмбриоскоп — это наиболее передовая на сегодняшний день система для выращивания и непрерывного наблюдения за развитием эмбрионов. Внутри устройства устанавливается камера, которая автоматически, через каждые несколько минут, фотографирует эмбрионы. Полученные снимки составляются в подробную видеозапись всего развития эмбриона. Анализ такой видеозаписи облегчает выбор эмбрионов с наилучшей динамикой деления и морфологии, и соответственно, самым большим потенциалом развития. Позволяет также идентифицировать нездоровые эмбрионы. Благодаря этому методу возможно ограничение количества переносимых в матку эмбрионов без снижения эффективности лечения, метод также позволяет избежать риска многоплодных беременностей. Эмбрионы с правильным развитием, которые не были перенесены в матку, замораживаются для дальнейшего использования в будущих циклах. Существует возможность анализа видеозаписи вместе с пациентами, что помогает понять имеющиеся проблемы, связанные с эффективностью лечения.
Данным методом могут воспользоваться все пары, однако он особенно рекомендуется для женщин старшего возраста, а также после многократного безуспешного лечения IVF. Наш опыт показывает, что применение данного метода позволяет получить существенно лучшие результаты лечения.
Надрез прозрачной оболочки эмбриона
Успешная имплантация, то есть приживления эмбриона на слизистой оболочке матки (эндометрия) зависит, в частности, от эффективного протекания процесса его звыхода (hatching) из прозрачной оболочки (zona pellucida – ZP). Это обеспечивает прямой контакт бластоцисты (эмбрион на стадии развития, способный к имплантации) с эндометрием. Бластоциста расширяется и давит изнутри на оболочку, которая разрывается и позволяет бластоцисте полностью выйти из нее. Данное явление называется выходом бластоцисты (blastocyst hatching). Иногда разрыв прозрачной оболочки не происходит, что делает невозможным контакт эмбриона с эндометрием, и, соответственно, имплантацию и беременность. Научные исследования, а также клиническое обследование подтверждают, что причины этого следует искать в морфологических факторах таких как: выше средней толщина прозрачной оболочки, фрагментация эмбриона или же слишком малое количество бластомеров (клеток), из которых состоит эмбрион. К прочим факторам, усложняющим выход бластоцисты, относится, вероятнее всего, возраст пациенток и связанное с этим явление отвердения оболочки (zona hardening). Доказано также, что замораживание и размораживание эмбрионов может стать причиной возникновения данного явления.
Assisted hatching — это лабораторный метод, заключающийся в утоньшении или полном вскрытии целостности прозрачной оболочки, окружающей эмбрион. Данная процедура облегчает бластоцисте „выход”, благодаря чему повышаются шансы на удачную имплантацию на слизистой оболочке матки. Она выполняется сразу перед трансфером — это касается как свежих эмбрионов, так и замороженных. Риск повреждения эмбриона очень низкий. Литературные данные однако свидетельствуют о повышенной частоте развития близнецовых однояйцевых беременностей после данной процедуры.
Показания для данной процедуры предусматривают:
- возраст женщины: старше 37-39 лет
- женщины с повышенным уровнем FSH на 1-3 день цикла
- морфология эмбриона: например, слишком толстая внешняя прозрачная оболочка, деление клеток с опозданием или высокий процент клеточной фрагментации
- в циклах после предварительных безуспешных попыток лечения IVF
- перед криотрансфером
Оценка сократительной функции матки
Перенос эмбрионов в матку является заключительным этапом лечения методом экстракорпорального оплодотворения. Эта короткая процедура является заключительным этапом трудоемких приготовлений, иногда сложной стимуляции, пункции яичников, затем всего эмбриологического этапа. На успешную имплантацию эмбрионов после трансфера влияют, главным образом, качество эмбрионов и так называемая рецептивность матки, т.е. „желание матки их принять”. Такими же важными являются также качество выполнения процедуры и условия для принятия эмбриона. Ключевым элементом, обуславливающим возможность имплантации, может быть чрезмерная (более 3 сокращения/3мин) сократительная функция матки. Сильные сокращения матки, как спонтанные, так и индуцированные травматической процедурой, могут снизить шансы на закрепление эмбриона в циклах IVF-ET, что влечет за собой удаление эмбрионов из матки после трансфера.
Чрезмерная сократительная функция матки наблюдается примерно у 1/3 пациенток, проходящих лечение методом IVF-ET. Результаты лечения (процент беременностей), полученные в данной группе пациентов, даже в 3 раза меньше по сравнению с пациентками с нормальной функцией. Как известно, сокращения матки обусловлены стимулированием окситоциновых рецепторов, что создает возможность фармакологического вмешательства. Подтверждено, что применение антагонистов окситоцинового рецептора (Atosiban — «Атосибан») уменьшает сократительную функцию матки и положительно влияет на имплантацию эмбрионов. Также установлено, что Атосибан не оказывает эмбриотоксических эффектов и его введение во время трансфера является безопасным. Предварительные клинические результаты исследований применения данного лекарственного средства указывают на повышение процента беременности у пациенток, проходящих лечение по программе IVF-ET. После периода предварительных научных исследований в нашем центре мы ввели данную процедуру как стандартную операцию для пациенток с диагностированной чрезмерной сократительной функцией.
